肌浆网钙ATP酶基因转导治疗急性心肌梗塞的实验研究

【摘要】目的：1)通过扩增和纯化重组腺病毒携带肌浆网钙ATP酶(rAd.SERCA2a)基因,获得高效价的rAd.SERCA2a基因,可满足基因转染浓度和数量的需要,同时也为扩增和纯化肌质网Ca2+-ATP酶(SERCA2a)基因提供一种稳定高效的实验方法,也为心力衰竭(HF)的基因治疗研究提供基础。2)本研究是建立在急性心肌梗塞(AMI)动物模型基础上,分别采用经典的骨髓干细胞(BMSC)治疗、SERCA2a基因治疗以及SERCA2a基因修饰的BMSC移植(BMSC+SERCA2a)治疗方法,运用组织病理技术,无创心电技术,超声技术,组织细胞电生理技术,对比三种方法治疗效果的差异性和优越性,分别探讨BMSC治疗AMI、转SERCA2a基因治疗心肌梗塞后心力衰竭的有效性,以及两者联合治疗的可行性,评价BMSC作为基因载体策略的可行性。本研究在改善心脏功能,纠正心梗后心力衰竭,防止心室重塑方面进行研究,重点探讨国、内外研究都比较薄弱的环节即：转SERCA2a基因治疗/BMSC移植治疗/BMSC+SERCA2a治疗AMI后的心脏电一机械匹配和电生理特性的改变,导致/减少/防止心律失常的发生进行评估,为以细胞移植为基础的基因治疗AMI提供临床应用基础。方法：1)复苏和传代人胚肾细胞(HEK-293),用100μl1.9×1012pfu/mlrAd.SERCA2a感染HEK-293细胞,出现细胞病变效应时收获细胞,经物理反复冻融方法及两步氯化铯超速离心方法获得纯化的rAd.SERCA2a,紫外分光光度计比色法测定病毒DNA质粒数。2)将急性心肌梗塞后心力衰竭动物模型制作成功的26只成年雄性SD大鼠随机分为3组：假手术组(n=10),空病毒对照组(rAd.β-gal组,n=8)和SERCA2a基因转染组(rAd.SERCA2a组,n=8)。假手术组仅开胸不结扎冠状动脉,rAd.β-gal组和rAd.SERCA2a组分别进行左冠状动脉前降支结扎建立大鼠心肌梗塞后心力衰竭动物模型,同时分别将携带β-gal和SERCA2a基因的重组腺病毒导入衰竭心脏,术后2周超声心电图检测心脏的舒张和收缩功能,心电图监测体表心电活动,微电极阵列(MEA)监测离体心脏组织电活动情况。3)建立成年雄性SD大鼠AMI模型(n=24)。随机分为3组：盐水对照组(对照组,n=8),BMSC移植组(BMSC组,n=8),SERCA2a基因修饰的BMSC移植组(BMSC+rAd.SERCA2a组,n=8)。术后2周进行心脏B超、体表心电图及MEA技术评估心功能和心脏电活动变化。4)制作成年雄性SD大鼠AMI动物模型(n=38)。随机分为5组：SERCA2a基因组(rAd.SERCA2a组,n=8),BMSC移植组(BMSC组,n=8),SERCA2a基因修饰的BMSC移植组(BMSC+rAd.SERCA2a组,n=8),盐水对照组(shame组,n=7),腺病毒空载体组(rAd.LacZ组,n=7)。术后2周记录体表心电图以及运用心脏二维超声评价心功能,HE染色评估心脏组织形态改变,运用MEA技术评估离体心脏组织电活动情况。结果：1)SERCA2a基因在HEK-293细胞成功呈绿色荧光表达,纯化的rAd.SERCA2a.GFPDNA质粒数为1.3±0.58×1012pfu/ml,OD260/OD280比值为1.57±0.49(n=50)。2)rAd携带SERCA2a与β-gal基因均成功转入大鼠衰竭心脏。Ad.SERCA2a组可改善心功能,与假手术组相比心室舒张末期容积与心室收缩末期容积有轻微的增加[(0.410±0.130)cm2对(0.39±0.02)cm2,(0.08±0.02)cm2对(0.06±0.01)cm2,P>0.05]、左心室射血分数[(82.3±4.59)%对(85.56±1.26)%,P>0.05]和短轴缩短率[(46.6±2.32)%对(49.58±1.71)%,P>0.05]无明显改变。与假手术组相比,rAd.β-gal组体表心电图QT间期延长[(111.02±7.42)ms对(94.7±1.55)ms,n=6,P<0.05],室性早搏发生率达71.5%(5/7),而rAd.SERCA2a组QT间期缩短[(81.45±4.97)ms对(94.7±1.55)ms,n=6,P<0.05],室性早搏发生率达14.3%(1/7)。MEA记录可发现rAd.SERCA2a组心率与假手术组相比差异无统计学意义[(435±31)bpm对(442±22)bpm,n=6,P>0.05],与rAd.β-gal组相比,rAd.SERCA2a组最大场电位[(0.82Q0.39)mV对(0.64±0.13)mV,n=6,P<0.05]、最小场电位[(1.88±0.57)mV对(1.35±0.12)mV,n=6,P<0.05]、场电位时限[(124.17±21.08)ms对(113.23±12.02)ms,n=6,P<0.05]均延长；rAd.β-gal组梗死区与梗死对侧区心肌组织场电位时限差异有统计学意义[(60.36±2.08)ms对(103.24±7.35)ms,n=5,P<0.05],并且60通道记录梗死区心肌组织场电位时程离散度大于rAd.SERCA2a组[(38.5ms±4.62)ms对(26.88±5.09)ms,n=5];rAd.SERCA2a组传导基本一致,使心肌梗塞面心室肌组织电活动呈均一性传导。3)rAd.SERCA2a基因对BMSC的感染效率为80%～90%。BMSC组、BMSC+rAd.SERCA2a组大鼠左室射血分数明显优于对照组(n=6,P<0.05)。BMSC+rAd.SERCA2a组大鼠体表心电图QT间期为(80.30±6.53)ms比对照组(105.31±21.89)ms少了23.8%(P<0.05),对照组室性早搏较多。MEA记录可发现梗死面心肌组织最大场电位BMSC组为(0.51±0.15)mV、BMSC+rAd.SERCA2a组为(0.55±0.16)mV,均明显高于对照组的(0.23±0.1)mV(P均<0.05),场电位时程BMSC组为(104.5±25.43)ms、BMSC+rAd.SERCA2a组为(107.67±24.01)ms,均显著长于对照组的(63±20.34)ms(P均<0.05)。BMSC+rAd.SERCA2a组传导时间最短,且能显著改善心梗面心室肌组织的均一性传导。4)rAd.SERCA2a组[(82.62±2.58)%]、BMSC组[(80.24±4.15)%]、BMSC+rAd.SERCA2a组[(84.28±2.46)%]与shame组[(70.49±3.27)%]相比射血分数均有明显改善(P<0.05,n=6),而rAd.LacZ组[(71.34±2.42)%]与shame组相比差异没有统计学意义(P>0.05,n=5)。体表心电图可发现与shame组[(102.42±20.67)ms,n=7]相比,QT间期在rAd.SERCA2a组[(83.07±17.56)ms,n=6]和BMSC+rAd.SERCA2a组[(81.20±5.64)ms,n=7]均值明显减少18.9%和20.7%(P<0.05),在shame组和rAd.LacZ组也出现较多的室性早搏。MEA记录可发现对照组离体心脏搏动频率明显减慢,并出现室性心律失常和房室传导阻滞。离体心脏组织场电位时程(FPdur)在rAd.SERCA2a组(121.25±18.64)msBMSC组(106.12±20.76)ms和BMSC+rAd.SERCA2a组(106.35±19.51)ms(n=6)显著长于shame组[(60.45±19.12)ms,n=6](P<0.05),其中rAd.SERCA2a组较显著地增加心梗区心室肌场电位及减少心律失常发生。rAd.SERCA2a组和BMSC+rAd.SERCA2a组能够从组织形态上阻止梗死心肌发生变性和坏死。结论：1)本研究建立了稳定可靠的借助HEK-293细胞培养扩增rAd.SERCA2a的实验方法,纯化后的高效价的SERCA2a基因的重组腺病毒可直接用于心血管疾病的动物实验研究,对重组腺病毒携带其他基因的扩增与提纯方法也具有一定的参考价值。2)BMSC是一种有效的基因治疗运载体。3)腺病毒载体介导的SERCA2a基因过度表达能够在短期内有效地增强心脏功能,增加梗死心脏的搏动频律和显著改善梗死心肌的电传导和减少心律失常发生。4)SERCA2a基因、BMSC移植以及SERCA2a基因修饰BMSC移植均可以明显改善心肌梗塞后心脏功能,但过表达SERCA2a基因可以减少心肌坏死和延缓心室重构,rAd.SERCA2a组可以更有效地增加心梗区心室肌场电位、改善心梗面心室的均一性传导,并能够预防心梗后心律失常的发生。5)MEA技术是一项检测心血管疾病动物模型心脏组织电生理节律和频率以及传导活动的理想技术。MEA技术在细胞或基因治疗的心脏电活动研究方面具有重要的应用价值。
【作者】范平；
【导师】侯月梅；马依彤；
【作者基本信息】新疆医科大学，内科学（专业学位），2013，博士
【关键词】肌浆网钙ATP酶；心肌梗塞；电传导；微电极阵列；骨髓干细胞；

【参考文献】
[1]陈群林.创造性成就与认知灵活性的关系[D].西南大学,基础心理学,2014,硕士.
[2]杨伟才.基于FPGA的嵌入式图形处理系统的设计[D].河北科技大学,测试计量技术及仪器,2013,硕士.
[3]马晓峰.维生素D对慢性阻塞性肺疾病的影响[D].兰州大学,内科学（专业学位）,2013,硕士.
[4]栾姗姗.新疆不同类型春小麦品种产量和品质形成规律研究[D].新疆农业大学,作物栽培学与耕作学,2012,硕士.
[5]周麟.操控理论下阿加莎﹒克里斯蒂侦探小说的翻译[D].重庆大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[6]黄倩.我国遗嘱执行人制度重构研究[D].湖南师范大学,民商法学,2014,硕士.
[7]马献忠.我国第二轮修志背景下地方史志管理研究[D].山东师范大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[8]谢小红,魏子栋.通过载体提高燃料电池催化剂的稳定性[J].电化学,2015,03:221-233.
[9]邹本涛.高速列车制动装置的温度场与热应力耦合分析[D].兰州理工大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[10]李晶.木榄内生真菌的分离鉴定及其次级代谢产物的研究[D].江苏科技大学,生物化学与分子生物学,2014,硕士.
[11]刘卫.预加固对软弱围岩隧道掌子面稳定性的影响研究[D].北京交通大学,建筑与土木工程（专业学位）,2013,硕士.
[12]袁园.瑞舒伐他汀联合B族维生素制剂对急性冠脉综合征患者内皮功能的影响[D].河北医科大学,内科学（专业学位）,2014,硕士.
[13]徐艳霞.OsABCB14参与水稻生长素转运及铁平衡[D].浙江大学,植物学,2014,博士.
[14]安东明.生物云环境下的Vlab架构的设计与实现[D].西安电子科技大学,计算机技术,2011,硕士.
[15]赵涛.煤巷复合顶板锚杆支护技术研究[D].西安科技大学,岩土工程,2014,硕士.
[16]申春玲.黄河鑫业公司人员严重流失问题与对策研究[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[17]胡蕾蕾.淫羊藿素（ICT）通过AhR与ER交互应答抑制乳腺癌的体外作用机制的研究[D].桂林医学院,病理学与病理生理学,2012,硕士.
[18]何瑞平.基于嵌入式和虚拟仪器技术的无线粮仓监测系统的设计与实现[D].西北大学,电路与系统,2014,硕士.
[19]刘晶晶.民生视角下现代养老社区服务体系研究[D].哈尔滨工业大学,管理科学与工程,2014,硕士.
[20]罗宇.基于四层软件结构的城乡用地规划系统耦合机制研究与实现[D].西南交通大学,地图制图学与地理信息工程,2012,硕士.
[21]韦新妍.我国零售业态的演变及其对绩效的影响[D].南京财经大学,产业经济学,2012,硕士.
[22]王玉哲.初中物理课堂有效提问的教学策略研究[D].山东师范大学,学科教学（专业学位）,2013,硕士.
[23]徐旺林,庞雄奇,吕淑英,MichaelRBerthold.动态概率神经网络及油气概率分布预测[J].石油地球物理勘探,2005,01:65-70+17-18+126.
[24]吴非.企业网上业务协同管理系统的设计[D].天津大学,软件工程,2013,硕士.
[25]范柯柯.幼儿园教师实践性知识形成的个案研究[D].首都师范大学,学前教育,2013,硕士.
[26]罗含丰.民工潮背后的农村养老——洞镇农村养老变迁研究[D].中央民族大学,社会学,2004,硕士.
[27]赵宇.玉米防衰增产化学调控的机制研究[D].河南农业大学,作物栽培学与耕作学,2012,硕士.
[28]孙云祥.蒙乃尔合金焊接时的有关技术要求[J].石油化工设备.1989(06)
[29]郝梦琳.手写体数字识别方法的研究与实现[D].太原科技大学,电路与系统,2013,硕士.
[30]巨云涛,吴文传,程学启,张伯明,孙宏斌.基于多源信息的配电网电流匹配状态估计[J].电力系统自动化,2012,16:53-57.
[31]凌云,郭向宇.非地表一致性噪声压制方法[J].石油地球物理勘探,1992,01:13-28+154.
[32]张小博.胆道感染患者胆汁中病原菌的分布及对药物的敏感性变化分析[D].吉林大学,外科学,2014,硕士.
[33]贾海龙.中国创业板市场beta系数影响因素的研究[D].浙江财经学院,金融学,2013,硕士.
[34]张娟锋,虞晓芬.土地资源配置体制与供给模式对房地产市场影响的路径分析[J].中国软科学,2011,05:29-36.
[35]谭立云,高学东,武森.数据挖掘方法与应用[J].华北科技学院学报,2004,02:52-55.
[36]习勤.网络统计学的理论体系探讨[J].华东交通大学学报,2003,03:4-7.
[37]裴芳芳.高职院校校企合作可持续发展模型与策略研究[D].山东师范大学,职业技术教育学,2013,硕士.
[38]尹宁宁.高等体育院校与艺术院校体育舞蹈专业人才培养模式的对比研究[D].山东体育学院,体育教学,2011,硕士.
[39]耿燕.中国移动密集市区无线网络规划与优化研究[D].吉林大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[40]王旦利.重组人促红细胞生成素致纯红细胞再生障碍性贫血5例临床观察[D].吉林大学,临床医学,2013,硕士.
[41]陈念.早期肠内营养配合柴芍六君子汤对大肠癌术后恢复影响的临床研究[D].湖南中医药大学,中西医结合临床,2013,硕士.
[42]罗越群.基于树核函数的汉语复句关系词特征分析[D].华中师范大学,计算机技术（专业学位）,2014,硕士.
[43]宿振伟.喀喇沁左翼蒙古族自治县地名研究[D].广西师范大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[44]杨天权.MicroRNA-16调控BCL2表达和NF-κB1/MMP-9信号通路抑制胶质瘤生长和侵袭的机制研究[D].苏州大学,神经外科学（专业学位）,2014,硕士.
[45]肖强.天津A仪表公司未来发展战略研究[D].西南交通大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[46]徐建民,李太生.江苏省工程技术文献信息中心建设的进展[J].新世纪图书馆.2005(01)
[47]宋可实.采煤塌陷区土地复垦适宜性评价研究[D].重庆大学,地质资源与地质工程,2014,硕士.
[48]刘雪媚.笛鲷属鱼类视蛋白基因的进化与表达分析[D].广东海洋大学,海洋生物学,2013,硕士.
[49]张顺文.基于LAMP的浏览器动态定制系统的设计与实现[D].华中师范大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[50]赵亮.三相电压型PWM整流方法的研究及DSP控制器的设计[D].湖南大学,电子科学与技术,2013,硕士.